特別WEBコラム　新型コロナウィルス禍に学ぶ応用物理 PCR法による検査（原理） 永井秀典 産業技術総合研究所

1.　まえがき

新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に関するニュース等において，ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の名称がしばしば取り上げられたこともあり，最近では，「PCR」という用語は世間一般にも広く知られる様になった．PCR法は，キャリー・マリス博士が，ベンチャー企業に在籍時に発明した核酸の増幅法であり，1993年度ノーベル化学賞を受賞するに至った技術である．DNAやRNAを扱う基礎研究のみならず，臨床検査や環境衛生，犯罪捜査といった幅広い領域にも，現在PCR法は利用されている¹⁾．

PCR法の基本原理を図1に示す．試料DNA（鋳型DNA）と，その中の標的配列を認識して挟む様に結合する2種類の20塩基程度の短い1本鎖オリゴDNA（プライマー）と，DNAの材料となる核酸モノマー（dNTP）に，それらを重合する耐熱性DNAポリメラーゼ酵素を混合してPCR溶液を調製する．そのPCR溶液を専用のサーマルサイクラーにて，二本鎖DNAを一本鎖に解離させる変性温度（約95 °C）と，プライマーを結合（アニーリング）させ一本鎖の鋳型DNAから2種類のプライマー配列に挟まれた領域を二本鎖DNAに複製する伸長温度（50〜70 °C程度）の間を繰り返し温度変化（サーマルサイクル）させることで，標的配列のDNAを指数関数的に増幅する手法である．また，RNAから逆転写反応（RT）によりDNAを合成後，PCR法に供する手法をRT-PCR法と呼び，特に，逆転写酵素をあらかじめ反応系に混合することで，RTとPCRを同一反応液中で行うRT-PCR法をOne-step RT-PCR法と呼ぶ．また，標的配列の合成と同時に蛍光を発するプローブを用いて，PCRによるDNA増幅と定量を同時に実施するリアルタイムPCR法，さらには，RTを組み合わせたリアルタイムRT-PCR法やリアルタイムOne-step RT-PCR法といった派生技術も広く利用されている．特に，リアルタイムPCR法については，複数の標的配列を同時に定量できる様に，異なる蛍光色素で標識したオリゴDNAタイプのプローブとプライマーのセットを複数混在させた系をマルチプレックスリアルタイムPCR法と呼び，感染症の多項目同時検査などに活用されている．

上述の通り，PCR法は手法の組み合わせにより多岐にわたるが，プライマーを用いて標的となる遺伝子配列を特異的に認識できる点が特徴である．仮にプライマーの長さが20塩基の場合，DNAの塩基は4種類であるから4²⁰（=1兆）種類の組み合わせが存在し，原理的に多種多様な生物種に対しても特異的に検出可能である．

そして，PCR法の最大の特徴は，理論上，反応液中に鋳型DNAが1分子でも存在すれば指数関数的に増幅することで，例えば40回のサーマルサイクルであれば，2⁴⁰（=1兆）倍まで増幅し，標的配列のDNAを極めて高感度に検出できることである．とはいえ実際には，試料DNAを数分子／反応まで希釈すると，確率的に反応液中にDNAを含まない場合が増え，サンプルサイズが少ないと検出が困難となり，現実的な検出限界は10〜100コピー/反応となる．

2.　新型コロナウイルスのPCR検査

2.1　新型コロナウイルスの標的遺伝子

新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）もRNAをゲノムとするRNAウイルスであることから，RT-PCR法により高感度に検出が可能である．新型コロナウイルスのPCR検査における標的遺伝子は，感染症対策を担う研究所が提供するプロトコルが国によって異なっているが，主には，ヌクレオ（N）タンパク質，エンベロープ（E）タンパク質，非構造タンパク質をコードするするORF1abやその一部のRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRP）が選定されている．本邦においては，国立感染症研究所のプロトコル（病原体検出マニュアル 2019-nCoV Ver.2.9.1）に従えば，リアルタイムOne-step RT-PCR法による検出には，Nタンパク質の2ヶ所の領域を標的としている．また，米国CDCではNタンパク質の3ヶ所，中国ではNタンパクとORF1ab，ドイツではRdRPとEタンパク，フランスではRdRPの2ヶ所とEタンパク質を標的としているが，Eタンパク質を除く各標的遺伝子については国毎に異なる配列を選定しており，国際的には統一されていない．なお，SARS-CoV-2においては，突然変異が頻発することが知られているため，標的遺伝子には1種類ではなく，複数種類を検査するプロトコルがほとんどである．

2.2　PCR検査の性能

PCR検査においては，標的配列の選定が検査の感度や特異度に影響するため極めて重要である．標的配列がゲノムに複数コピー存在すれば検出限界において有利に働くし，一方，ヒトゲノムやその他の病原体の遺伝子配列と相同性が高いと特異度において問題となる．また，プローブを用いるリアルタイムPCR法においては，鋳型DNAとの結合親和性に寄与するプライマーとプローブの融解温度（Tm）のバランスも重要なファクターであり，プローブのTmがプライマーに比べ低めであると，プローブの利用効率が低下し感度も低下する．実際に，SARS-CoV-2の代表的な標的遺伝子ごとに検査キットの性能を比較した結果，標的遺伝子によって感度が異なるという報告がある²⁾．

また，PCR検査の性能として，検査時間と処理能力も用途に合わせ考慮すべきである．最も汎用的なリアルタイムPCR装置のスペックにおいては，遺伝子増幅に1〜2時間を要するが96サンプルを同時に検査可能である．時間あたりの処理数（スループット）で考えると，0.8〜1.6サンプル/分であるが，当然，検体が届いてから1分程度で検査ができるわけではない．大量の検体を集めて纏めて検査する場合には，同時処理能力を重視すべきであるが，例えばクリニックの様に，次々と検体が提出され速やかに結果を返す必要がある場合，検査時間の迅速さが求められる．

2.3　高速PCR技術

そのため，PCR検査の迅速化のため，高速なサーマルサイクラーの開発が長年進められてきた^3–5)．高速な温度変化には，大過剰の熱量を供給すれば良いが，通常PCR溶液は12〜25 µlと僅かなため，急激な温度変化条件はオーバーシュートを招き，容易に変性温度の95 °Cを超えて瞬時に蒸発しかねない．そこで，あらかじめPCR法に必要な変性温度と伸長温度のヒーターを複数用意しておき，それらに接する様に数十〜数百 µm幅のマイクロ流路を配置し，その中をPCR溶液が送液することで，繰り返し変性温度と伸長温度に交互に触れるサーマルサイクラーが考案された（図2）^3,6,7)．この原理であれば，マイクロ流路を介して高速な熱交換が可能であるが，変性温度以上に加熱される恐れは全くない．また，容器となるマイクロ流路のヒーター接触部は，常に一定温度に加熱された状態であるから，実際に温度変化する物体は，マイクロ流路内を移動するPCR溶液のみであり，理論上最も効率的と言える．実験により確かめられた温度変化の平均速度は約18 °C/sであり，実際に40サイクルのPCR検査を比べた場合，汎用機の1時間に比べ7分以内までPCRの時間を短縮可能であった．この高速PCR技術を用いて，SARS-CoV-2のゲノムRNAからリアルタイムOne-step RT-PCR法により検出感度を確認した場合，検出限界レベルの10コピー/反応の濃度であっても，15分以内に検出が可能であった⁸⁾．

3.　むすび

上述の高速PCR技術を用いたSARS-CoV-2に対する機器と検査試薬は既に市販化されているが，検体採取や試料前処理を含めた精度管理などPCR法以外のプロセスも肝要である．今後，採取が容易な唾液を用いた検査や，前処理不要なPCR試薬の活用が進めば，SARS-CoV-2のPCR検査はより身近になると考えられる．そして，SARS-CoV-2をはじめ様々な新興ウイルス感染症に対して，PCR検査が空港の検疫等の迅速検査として活用され，我々の安全と安心を守るために活用されることを期待している．

文献

• 1) Y.M. Denis Lo, Rossa W.K. Chiu and K.C. Allen Chan: Clinical Applications of PCR (Human Press, 2006).
• 2) X. Liu, J. Feng, Q. Zhang, D, Guo, L. Zhang, T. Suo, W. Hu, M. Guo, X. Wang, Z. Huang, Y. Xiong, G. Chen, Y. Chen and K. Lan: Emerg. Microbes. Infec. 9, 1175 (2020).
• 3) M.U. Kopp, A.J.de Mello and A. Manz: Science 280, 1046 (1998).
• 4) E.K. Wheeler, C.A. Hara, J.Frank, .J. Deotte, S.B. Hall, W. Benett, C. Spadaccini and N.R. Beer: Analyst 136, 3707 (2011).
• 5) P. Neuzil, C. Zhang, J. Pipper, S. Oh and L. Zhuo: Nucleic Acids Res. 34, e77 (2006).
• 6) S. Furutani, N. Naruishi, Y. HAgihara and H. Nagai: Anal. Bioanal. Chem. 408, 5641 (2016).
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• 8) J. Sakai, N. Tarumoto, Y. Orihara, R. Kawamura, M. Kodama, N. Matsuzaki, R. Matsumura, K. Okane, T. Kawamura, S. Takeuchi, K. Imai, T. Murakami and T. Maeda: J. Hosp. Infect. 105, 615 (2020).

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